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分子克隆与质粒载体构建
  • 作者:admin
  • 发表时间:2018-08-08 10:04
  • 来源:未知

 

     外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠杆菌连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
     T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步:首先,T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物;然后,酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。
     DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法,为了防止载体本身的自连,可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服。
     连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下,粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。


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